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胚胎和成年斑马鱼心脏离子通道AP测量系统
作者:admin   时间:2018-01-17

 

(CellFish system)
The AP measurement of the embryonic and adult zebrafish heart ion channels

 

MDE 公司通过标准的微电极技术,多年来已成功的设计开发了自己独特的工作站。更深入的开发了针对胚胎(the embryonic)和成年斑马鱼心脏(adult zebrafish heart)离子通道( ion channels)电压响应(AP)的测量-----CellFish system。


标准微电极方法优势(The advantage of the standard microelectrode method)


近几十年来研究证明,斑马鱼是心脏研究的首选研究课题,尤其是心脏生理和药理试验,斑马鱼心脏电生理学显示了许多相似点,目前使用的哺乳动物实验模型,例如:离子通道(ion channels)、心电图(ECG)等,它有一个独特的生理发展适应性。基于相似性的发现,应用在哺乳动物的细胞(cellular)技术(标准微电极(standard microelectrode)、膜片钳(patch clamp))也用于对斑马鱼的研究了。

 

 

Atrial and ventricular cardiac action potentials
成年斑马鱼the adult zebrafish (A),人类human(B)和小鼠mouse (C)心房和心室心脏动作电位


图中分别是成年斑马鱼the adult zebrafish (A),人类human(B)和小鼠mouse (C)的心房(左列)和心室(右列)心脏动作电位的代表性图形,斑马鱼自发的搏动的心脏APs记录是在28°下测量的,而人类和小鼠心脏组织是在37°C下通过1赫兹的频率刺激测定的,斑马鱼的记录是从心室的心尖一半和从心房的中心区域获得。
标准微电极技术的优点是,横跨膜的变化记录从制备电极刺穿到放大器,在一个细胞的准备、电极的尖端检测细胞内空间与细胞外空间的电势变化。这种技术确保了细胞内外空间之间的电压变化,由此可对所引起的给定区域的所有活跃的离子通道进行测量,测量方法获得的ECG信号,定义了心电图(ECG)的曲线形成,该心脏生理检查方法的曲线形成已在临床实践中广泛使用。

 

 

系统组成
1. 机械单元(Mechanical unit);
2. 测量系统(Measuring system):
① 高输入阻抗(High input impedance)、低噪声放大器 low noise amplifier );
② 数据显示、存储和分析硬件/软件(EASY-CEL);


机械单元(The mechanical unit):
它的底部是一个高度稳定,无振动平台,从而保持了成鱼 (adult)和胚胎标本(embryonic specimen)的制备,各组件功能:

 

                           
     Mechanical unit(机械装置)                    Flowchart the mechanical unit(机械装置流程图)
 
1) 成鱼心脏解剖器官浴模式(The organbath modes for adult fish heart dissection)


开循环(Open circuit)
生理溶液在器官浴里不断流动和保持合适的液体水位便于泵抽吸。

 

闭循环(Closed circuit)
流动的生理溶液中止:龙头1闭合,龙头3打开时泵就停止,该溶液就可以添加到器官里。

 

 
2) 试验装置(The setup of equipment necessary for the experiment)
系统设计优点之一是所必需的试验设备(pl:操纵器(manipulators)、器官浴(organ bath)、灯光( lighting)、等等)被安装在工作台最佳位置,另一个优点是试验人员可以灵活的改变工作台上的器官浴位置,以适应任何的物种,设定穿刺由器官浴的纵向可调支承的位置。该解决方案允许多个胚胎的同时测量。

 

 

The mechanical design of the system
        

      

 

   Embryo in the bath 浴槽里胚胎                    The organ bath 器官浴槽
 
测量系统(The measuring system)


包含组件:

1. 高输入阻抗(high input impedance(1012Ώ),
低噪音(low noise),低容量(low capacity(25pF) 放大器,
2. 隔离刺激器(isolated stimulator end stage 10V/10mA),
3. INTRASYS测量、分析和数据存储软硬件系统与刺激器模块。
为了避免外部噪声污染(由于该系统不包含任何过滤器),并保持容量低,与力学共同的屏蔽接地点已被设计好。通过这一点,我们可连接到法拉第笼的屏蔽接地(GND)。

 

               测量系统(The measuring system)
 
1) 放大器(amplifier)
该放大器是为标准的微电极技术开发的,应用技术解决方案允许使用10MΩ和100MΩ之间的玻璃电极的AP信号精确传输。放大器包含两部分:一个是““INTE”高输入阻抗前置放大器,它可以直接连接到电极套管(例如:WPI, Harvard, Clark, etc.);另一元件是功率放大器,其中包含先前描述的电路元件,并且提供了连接到数据成像,存储和分析用硬件-软件系统(EASY-CEL)。

 

为了实现这些有利的参数,线性放大器被选为参考接地,所有的这些服务功能由放大器提供(例如:容量补偿(capacity compensation)、电阻测量(resistance measurement),直流电极接触电势取消(DC electrode contact potential cancellation )等)都可以通过不断的电阻(1Ώ)参考接地。

 

                                    

             preamplifier                                                                 amplifier
 
2) EASY-CEL 软硬件
EASY-CEL是一个单通道存储示波器软件,该软件可被用于显示,存储和分析细胞内外电位,引发在心脏或任何其他解剖区域(例如:脑(brain)、骨髓( bone marrow)等)的体内( in-vivo)或体外(in-vitro)的方法。

 

      

                                           
心脏单细胞(Heart single-cell registration)
对于与标准的微电极技术测量心脏的AP曲线,在联机模式中的以下参数被显示,分析和存储,在测量过程中。在后期的脱机模式下的AP曲线和保存的参数可被重新分析和修饰:
1. RP – rest potential
2. TOP – taking off potential
3. APA1 – AP to the RP = OS – RP
4. APA2 – AP to the MDP =OS – MDP
5. MDP – minimum potential
6. OS – overshot
7. APD10 –10% coming back
8. APD25 –25% coming back
9. APD50 –50% coming back
10. APD75 –75% coming back
11. APD90 - 90% coming back
12. APD50mV –50mV coming back
13. CT – leading time
14. dVmax – the fastest point of the rising branch of the sign
15. dVmin – the fastest point of the descending branch of the signal

 

                         

          Software surface                                     Analyzed parameters
 
存储模式(Store mode)

提供有主曲线显示,某一个特定时刻的存储、在测量过程中的任何时间、并比较该曲线与在该时刻测量或监测的曲线。此外,还有一种可能性,以计算平均距离的曲线。


                  

              Store mode                                       Average mode
 
刺激隔离器(Internal stimulator with isolated power output stage)
Parameter ranges:参数范围:
1. 脉冲周期Pulse Period (PP)500μs...999 s
2. 延迟Delay (DE)0.1μs...999 s
3. 脉冲宽度Impulse Width (PW)10μs.. .999 s
4. 训练延迟Train Delay (TD)10 μs...999 s
5. 训练编号Train Number (TN) 1 ... 999
 
刺激隔离器性能规格:
1. 最大输出电压Max. output voltage ± 10 V, ± 100 V
2. 电流限制Current limit ± 10 mA, ± 100 mA

 

    

        Stimulator settings                                   Stimulator module
 
系统配置:
完整的工作站(Complete Workstation): 包含放大器,硬件接口,软件,刺激隔离器和电脑。

 

      

 

                   
               
     
附件(Additional devices) :

        


 法拉第笼KFA Faraday cage                   球形操纵器带刺激电极                             精密操纵器 (1μm/pace X,Y plane)